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熒光定量PCR儀的外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量有何區(qū)別?
更新時(shí)間:2021-03-29   點(diǎn)擊次數(shù):4716次
  1、內(nèi)標(biāo)對(duì)熒光定量PCR儀的影響
  若在待測(cè)樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo),則 PCR 反應(yīng)變?yōu)殡p重 PCR,雙重 PCR 反應(yīng) 中存在兩種模板之間的干擾和競(jìng)爭(zhēng),尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí),這種競(jìng)爭(zhēng)會(huì)表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)是未知的,所以無(wú)法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因,傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo),但仍然只是一種半定量的方法。
  2、熒光定量 PCR 無(wú)需內(nèi)標(biāo)定量
  熒光定量PCR儀技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限,實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán) 均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度,并記錄在電腦軟件之中,通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品 Ct 值的計(jì)算,根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的:
  (1)Ct 值的高度重現(xiàn)性 PCR 循環(huán)在到達(dá) Ct 值所在的循環(huán)數(shù)時(shí),剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期(對(duì)數(shù)期),此時(shí)微小誤差尚未放大,因此 Ct 值的重現(xiàn)性*,即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增,得到的 Ct 值是恒定的。
  (2)Ct 值與起始模板的線性關(guān)系由于 Ct 值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定, 因此,實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
  外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較,得出的結(jié)論是:內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的,而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。熒光定量PCR儀
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